Khảo sát khả năng thuỷ phân protein từ phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme bromelain

Để tận dụng và nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn phụ phẩm là protein trong quá trình chế biến cá Tra phi lê đông lạnh, nghiên cứu thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra sử dụng enzyme bromelain thương mại chiết xuất từ thân khóm (EC 3.4.22.32) đã được thực hiện. Kết quả cho thấy hàm lượng protein trung bình trong phụ phẩm từ đầu, vây là 17,363g/100g nguyên liệu. Đây là nguồn nguyên liệu có thành phần dinh dưỡng cao. Điều kiện thủy phân tối ưu cho bromealin trên cơ chất protein từ phụ phẩm trên là pH 6,5 và nhiệt độ là 55^oC. Kết quả thủy phân đã xác định được cặp tỉ lệ enzyme và cơ chất thích hợp là 1,5mg Enzyme (E)/ 1,042g protein cho hiệu suất cao và ổn định trong 120 phút, với hiệu suất đạt 22,75% (tính theo lượng tyrosin giải phóng ra). Kết quả phân tích protein được thủy phân trên điện di đồ SDS-PAGE cho thấy hầu hết protein từ thịt phụ phẩm cá Tra đã được thủy phân thành dạng peptide phân tử lượng thấp cũng như hỗn hợp các acid amin với hàm lượng cao. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoàn toàn có thể thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra bằng bromelain để sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường bờ biển dài, nên rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Ngành nuôi cá Tra, Basa của Việt Nam phát triển mạnh trong những năm qua do nhu cầu lớn từ các thị trường xuất khẩu. Do điều kiện thiên nhiên thuận lợi và chế độ nuôi dễ dàng cũng như giá trị xuất khẩu cao, xuất khẩu cá Tra, Basa đã chiếm tỷ trọng chủ yếu trong xuất khẩu cá da trơn. Sản lượng cá Tra nguyên liệu năm 2012 đạt 1190 tấn, cung cấp trên 87% sản lượng cá Tra chế biến của cả nước. Tuy nhiên, sự phát triển của ngành thủy sản vẫn còn có những vấn đề bắt cập, đó là lượng phụ phẩm sau phi lê bao gồm: thịt vụn, đầu, xương, vây tăng tỷ lệ thuận với lượng cá fillet xuất khẩu. Trung bình sản xuất 1 kg thành phẩm cá fillet đông lạnh cần khoảng 2,6 kg cá nguyên liệu. Như vậy, lượng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến cá Tra fillet đông lạnh đạt khoảng 450.000-480.000 tấn phụ phẩm/năm. Đây là nguồn phụ phẩm rất lớn, nếu không có biện pháp xử lý thích hợp sẽ gây ô nhiễm môi trường trầm trọng. Trước tình hình trên, việc nghiên cứu các sản phẩm từ phụ phẩm cá Tra sau fillet là rất cần thiết. Hiện nay phương pháp xử lý nguồn phụ phẩm này bằng các biện pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt sử dụng enzyme thủy phân để thu hồi protein do tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao (Min – Tian & cs,2005). 

Enzyme bromelain là nhóm endo-protease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là peptide (Christian & cs,2001). Bromelain hiện diện trong tất cả các phần của cây khóm (thân, chồi, quả). Tuy nhiên, chúng chiếm trên 50% protein trong quả dứa. Trọng lượng phân tử của bromelain khoảng 23kDa (Muarer, 2001). Ở mỗi bộ phận khác nhau trên trái khóm thì bromelain có pH tối ưu và cấu tạo khác nhau. Enzyme này hoạt động tốt nhất ở vùng pH 6-8, trong khoảng nhiệt độ 40- 65^oC. Về khả năng xúc tác của bromelain, enzyme này có ba hoạt tính khác nhau là peptidease, amidase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA (Benzolyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzolyl-L-Arginine Ethyl Esther), BAEM (Benzolyl-L-Arginine Methyl Esther) (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Với khả năng phân giải protein hiệu quả và khả năng thu nhận dễ dàng từ quá trình chế biến khóm ở Đồng bằng sông Cửu Long,việc thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra bằng bromelain để tạo ra sản phẩm giá trị cao hơn phục vụ việc sản xuất thức ăn cho người và vật nuôi là cần thiết và có ý nghĩa ứng dụng. 

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chuẩn bị nguyên vật liệu 

Phụ phẩm cá Tra (đầu, vây, xương và nội tạng) được thu mua từ nhà máy Caseamex, tại khu Công nghiệp Trà Nóc, Cần Thơ. Phụ phẩm sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ để tiến hành loại bỏ nội tạng, rửa sạch loại bỏ máu, mỡ. Sau đó, nguyên liệu được hấp sơ bộ trong 15 phút, loại bỏ xương, vây. Phần protein từ thịt cá được xay nhỏ và được trữ ở -20^oC để thực hiện thí nghiệm thủy phân.  

Bromelain (từ thân khóm E.C.3.4.22.32) có xuất xứ tại Đức, nhập khẩu từ công ty TNHH Merck VN. Các hóa chất phân tích khác có nguồn gốc từ Sigma Alrich.

Phương pháp xác định các tham số hóa lý

Xác định ẩm độ của phụ phẩm cá Tra nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (Conie và Jame, 2003), xác định hàm lượng đạm tổng số trong thịt cá Tra nguyên liệu bằng phương pháp Kjeldahl (Conie vàJame, 2003), xác định hàm lượng béo trong thịt cá nguyên liệu bằng phương pháp Soxleht (Conie and Jame, 2003), xác định tyrosin sinh ra theo phương pháp Anson (Simon Roe, 2001) và xác định hàm lượng đạm amin sinh ra sau thủy phân theo phương pháp OPA (AOAC, 2010). 

Phương pháp bố trí và xử lý số liệu: 

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên cùng một nguyên liệu. Kết quả được xử lý bằng phần mềm ứng dụng MS. Excel 2010. Tính toán thống kê, phân tích phương sai, kiểm định LSD bằng phần mềm Stagraphic 16.1.18. Xác định các thông số động học V_max, K_m bằng phần mềm SAS 9.1.3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thành phần hóa học trong nguyên liệu ban đầu

Bảng 1. Hàm lượng các thành phần hóa học trong nguyên liệu thịt cá Tra

 Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng protein tổng số có trong phụ phẩm cá là 17,36%, tương ứng với 17,36 g protein/ 100 g nguyên liệu (Bảng 1). Theo Trần Văn Chương (2001), hàm lượng protein tổng số trong phụ phẩm cá tra là 17%, lipid là 3,5% và ẩm độ là 79%. Sự khác biệt này là do thành phần hóa học trong cá bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như môi trường, thức ăn, kích cỡ cá và đặc tính di truyền. Trong thí nghiệm của chúng tôi nguyên liệu trong thí nghiệm này có độ ẩm thấp hơn (đạt 63,46%) hàm lượng protein và hàm lượng lipit là cao hơn, chứng tỏ đây là nguồn nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng cao phù hợp trong chế biến nhiều sản phẩm có giá trị.

Xác định các thông số động học của bromelain trên cơ chất phụ phẩm cá Tra

Mỗi loại enzyme đều có những điều kiện tối ưu cho quá trình xúc tác. Để xác định được cơ chất và nồng độ tối ưu cho bromelain cần khảo sát động học của enzyme để tìm ra giá trị V_max và K_m. Sử dụng phần mềm SAS 9.1.3, các thông số V_max, K_m của bromelain trên cơ chất là phụ phẩm cá đã được xác định. Kết quả cho thấy các giá trị V_max và K_m lần lượt là 0,4656 µmol tyrosin/phút và 0,101 gam protein/10ml. Đồ thị hình 1 cho thấy, vận tốc phản ứng (V) (tương ứng tốc độ tyrosin giải phóng ra) thay đổi tuyến tính với nồng độ cơ chất (S) khi nồng độ cơ chất nhỏ (từ 0,1 g đến 1 g). Khi nồng độ cơ chất tăng cao thì vận tốc tăng tới mức nào đó và không tăng nữa. Đồ thị mô phỏng đúng theo đồ thị phương trình Michaelis-Menten. 

Kết quả nghiên cứu của Carlos & cs (2012) về hằng số tốc độ phản ứng của bromelain ở các cơ chất khác nhau như sau: casein (0,138), azocasein (0,037), azoalbumin (0,026), sodium casemate (0,088) và hemoglobin (0,165). Như vậy, hằng số tốc độ phản ứng trên cơ chất phụ phẩm cá Tra K_m = 0,101), là thấp hơn so với với cơ chất chuẩn casein, chứng tỏ ái lực của bromelain trên cơ chất phụ phẩm cá lớn hơn so với cơ chất chuẩn. Điều này đồng nghĩa với việc vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác đạt giá trị V_max trên cơ chất phụ phẩm cá nhanh hơn. Như vậy, quá trình khảo sát động học của bromelain đã cho thấy có thể sử dụng enzyme này để thủy phân phụ phẩm cá Tra.

Tỉ lệ nồng độ enzyme và cơ chất E/S tối ưu

Kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1 cho phép xác định được nồng độ cơ chất mà tại đó vận tốc phản ứng bắt đầu giảm. Cặp tỉ lệ 6 g cơ chất/1,5 mg enzyme đã được lựa chọn để tối ưu nồng độ E/S. Trong thí nghiệm ở đây, enzyme tiếp tục được tăng theo các hệ số 1,2; 1,4; 1,5; 2 và tiến hành thủy phân trong 30 phút. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Hàm lượng đạm amin và tyrosin sinh ra sau thủy phân

Khi tăng cặp tỉ lệ E/S theo các hệ số đã lựa chọn thì vận tốc phản ứng của enzyme có xu hướng giảm, được thể hiện bằng hàm lượng tyrosin giải phóng ra (mg tyrosin/g protein) giảm. Kết quả thống kê, kiểm định LSD về ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ enzyme/ cơ chất đến hàm lượng tyrosin giải phóng ra cho thấy rằng cặp tỉ lệ nồng độ enzyme/ cơ chất tương ứng 1,5/1,042 (mg enzyme/g protein) cho hàm lượng tyrosin cao nhất (5,239 mg tyrosin/g protein). Kết quả thống kê cũng cho thấy hàm lượng đạm amin sinh ra giảm dần khi tăng cặp tỉ lệ E/S lên hệ số càng cao. Tuy nhiên, ở cặp tỉ lệ 1,5/1,042 (mg enzyme/g protein) hàm lượng đạm amin sinh ra không có sự khác biệt ý nghĩa so với 1,8/1,250 (mg enzyme/g protein). Để tiết kiệm chi phí nguồn nguyên liệu và enzyme sử dụng, cặp tỉ lệ 1,5/1,042 (mg enzyme/ g protein) đã đươc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 

Thời gian thủy phân tối ưu

Theo kết quả nghiên cứu của Scottawat và Michael (1997) thì hiệu suất thủy phân của enzyme có thể tính bằng hàm lượng amino acid giải phóng ra (khi thủy phân tại một thời điểm bất kì) trên hàm lượng amino acid tổng số trong cùng một khối lượng cơ chất. Vì vậy, có thể xác định hiệu suất thủy phân dựa vào hàm lượng tyrosin giải phóng ra trên hàm lượng tyrosin tổng trong cùng một đơn vị khối lượng. Nghiên cứu tương tự của Nielsen & cs (2011) cho thấy hiệu suất thủy phân của enzyme cũng có thể xác định được bằng hàm lượng đạm amin sinh ra trên hàm lượng đạm tổng số. 

Hàm lượng tyrosin tổng được xác định bằng cách thủy phân hoàn toàn 1g protein bằng acid HCl 6N ở 100^oC trong 36 giờ cho kết quả là 2,365 g tyrosin/100 g protein. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ghaly & cs (2013) về tiềm năng chế biến protein, amino acid và dầu từ phế liệu cá. Các tác giả đã thu được hàm lượng tyrosin tổng là 2,4 gam tyrosin/100gam protein. Đồ thị hình 2 cho thấy hiệu suất thủy phân của bromelain theo hàm lượng tyrosin giải phóng ra tăng theo thời gian thủy phân. Tuy nhiên, hiệu suất thủy phân chỉ tăng nhanh trong 120 phút đầu (đạt 22,750%). Thời gian càng dài về sau thì hiệu suất thủy phân càng tăng nhưng tăng chậm. Tại thời điểm 240 phút thì hiệu suất thủy phân đạt được 24,016%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Tạ Hùng Cường (2014). 

Tác giả này cũng phát hiện thấy hiệu suất thủy phân của bromelain trên cơ chất thịt dè cá Tra (thịt đỏ được loại ra từ miếng cá tra phi lê) cũng tăng nhanh trong 120 phút, sau đó thì tăng chậm lại. 

Trong quá trình thủy phân cơ thịt đầu cá bằng bromelain, sản phẩm tạo thành là các acid amin và những peptide mạch ngắn. Đồ thị ở hình 3 cho thấy thời gian thủy phân càng dài thì hàm lượng đạm amin sinh ra càng tăng. Bromelain là một enzyme endo-peptidase phân cắt bên trong phân tử protein tạo ra sản phẩm là các đoạn peptide mạch ngắn (Lê Kim Thanh, 2007). Do đó, thời gian thủy phân càng dài về sau, mạch peptide càng ngắn. Những peptide mạch ngắn này tạo phức với hợp chất OPA được hấp thụ ở bước sóng 340 nm nên hàm lượng đạm amin tăng lên. Sau 240 phút thủy phân với bromelain, hiệu suất đạt 9,7%.

Mức độ thủy phân của enzyme trên cơ chất phụ phẩm cá

Điện di SDS-PAGE nhằm mục đích so sánh khả năng hình thành peptide và acid amin trước và sau khi khi sử dụng bromelain trên cơ chất phụ phẩm cá Tra. Khả năng thủy phân của enzyme có hiệu quả khi sản phẩm tạo thành là các acid amin và peptide có trọng lượng phân tử thấp, di chuyển về phía dưới bản gel điện di. Sau khi xác đinh được cặp tỉ lệ E/S tối ưu, phụ phẩm cá Tra được tiến hành thủy phân ở 2 mốc thời gian là 30 phút và 90 phút. Dung dịch sau thủy phân ở nồng độ 2mg/ml được chạy điện di trên gel polyacrylaminde 10%.

Điện di đồ ở hình 4 cho thấy dung dịch ban đầu chưa thủy phân có trọng lượng phân tử lớn từ 15-250 kDa. Đối với enzyme papain, sau 30 phút thủy phân thì dung dịch vẫn còn các phân tử peptide có trọng lượng lớn, dưới 40 kDa. Trong khi đó, bromelain thủy phân trên cơ chất thịt dè và thịt đầu cá thì sau 30 phút thủy phân sản phẩm tạo thành là những peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, dưới 20 kDa, sau 90 phút thủy phân thì hầu như tạo thành các peptide có khối lượng phân tử rất nhỏ, dưới 10kDa (số liệu không trình bày). Từ hình ảnh điện di SDS-PAGE có thể kết luận rằng khả năng thủy phân của bromelain trên protein từ phụ phẩm cá Tra là rất tốt. 

KẾT LUẬN

Bromelain có V_max và K_m lần lượt là 0,03 (µM tyrosin/phút) và 0,099 g protein. Tỉ lệ E/S (1,5mg/1,042g protein) cho hàm lượng tyrosin giải phóng ra cao nhất. Sau 120 phút, hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosin là 22,75% và hiệu suất thủy phân theo hàm lượng đạm amin ở 240 phút là 9,7%. Kết quả nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng bromelain để thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra.

Nguyễn Công Hà^*1 , Nguyễn T Bích Phương¹, Lê Nguyễn Đoan Duy¹, Nguyễn T Thủy²

¹ Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường ĐH Cần Thơ

² Bộ môn Chăn nuôi, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ