Tổng số 120 vi khuẩn được phân lập trên môi trường LB (Lauryl Tryptose Broth), trong đó 60 chủng phân lập mẫu từ ruột heo và 60 chủng từ đất trại chăn nuôi heo tại 4 tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng và Hậu Giang. Từ kết quả khảo sát đặc tính sinh học, khả năng bắt màu nhuộm Gram, khả năng di động và sinh bào tử tuyển chọn được 4 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus (12,5%). Kết quả khảo sát trong môi trường pH thấp, cả 4 chủng đều có khả năng chống chịu tốt, đặc biệt chủng ST.R.B9 và CM.Đ.B14 có mật độ cao là 6,1 log CFU/ml. Tỷ lệ mật độ của 4 chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ với muối mật 0,3% đều tăng so với thời gian ban đầu, trong đó chủng CM.Đ.B14 tăng mạnh và ổn định (42%). Bên cạnh đó, 2 chủng ST.R.B9 và CM.Đ.B14 khả năng kháng lại ampicillin và tetracylin chiếm 50%. Kết quả cũng cho thấy khả năng tự bám dính của cả 4 chủng Bacillus có xu hướng tăng dần từ 0 giờ đến 4 giờ, trong đó chủng CM.Đ.B14 có tỷ lệ bám dính cao nhất (37,1%). Tóm lại, kết quả bước đầu cho thấy hai chủng vi khuẩn ST.R.B9 và CM.Đ.B14 mang các đặc tính probiotic, có tiềm năng sử dụng làm chế phẩm sinh học phục vụ trong chăn nuôi heo.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc dùng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho người và động vật có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế nhưng cũng đồng thời tạo nên áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Sử dụng kháng sinh không kiểm soát trong lĩnh vực chăn nuôi là một trong những tác nhân chính làm gia tăng sự đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh. Do đó, việc tìm ra phương pháp an toàn trong điều trị là rất cần thiết và chế phẩm probiotic đang được đánh giá là giải pháp thay thế hiệu quả, an toàn, bền vững đối với người chăn nuôi và người tiêu dùng. Mật độ và khả năng sống sót của vi khuẩn là những tiêu chí quan trọng để vi khuẩn probiotic mang lại hiệu quả cho vật nuôi (Boke và ctv, 2010). Trong đó, chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic cần đảm bảo khả năng tồn tại và duy trì trong điều kiện pH thấp, chống chịu muối mật, kháng với các loại kháng sinh và tự bám dính. Chỉ khi đáp ứng được các yêu cầu trên thì vi khuẩn mới có khả năng phát huy được vai trò khi được đưa vào hệ tiêu hóa vật chủ, ngược lại một chủng vi khuẩn dù mang nhiều đặc tính có lợi cũng không thể phát huy được vai trò của nó. Vì vậy, các chỉ tiêu trên rất quan trọng trong quá trình chọn lọc vi khuẩn có đặc tính probiotic.Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ mẫu dịch ruột non của heo và mẫu đất xung quanh trại chăn nuôi heo, có khả năng chống chịu được môi trường pH thấp, muối mật, kháng các loại kháng sinh và khả năng tự bám dính làm tiền đề cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học ứng dụng trong chăn nuôi heo.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Được tiến hành từ tháng 12/2017 đến tháng 7/2018 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2.2. Phương pháp thí nghiệm
Mẫu được thu từ mẫu ruột và mẫu đất. Phân lập và tách thuần tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường LB đến khi đạt độ ròng nhất định. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn đã phân lập: Khả năng bắt màu nhuộm Gram, khả năng di động và khả năng sinh bào tử. Khảo sát các đặc tính các chủng vi khuẩn phân lập được để đánh giá tiềm năng probiotic: khả năng chịu pH thấp, khả năng chịu muối mật, khả năng kháng kháng sinh và khả năng bám dính.
2.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp thu thập số liệu
2.3.1. Mẫu và cách thu mẫu
Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), mỗi tỉnh thu 30 mẫu. Tổng cộng 120 mẫu thuộc 4 tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau.
Mẫu ruột: Mỗi tỉnh thu 15 mẫu từ 15 cá thể heo thịt giết mổ tại 4 lò mổ. Mỗi mẫu hút 1 ml dịch chứa trong ruột non rồi sau đó cho dịch hút vào ống Eppendorf vô trùng và bảo quản trữ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC, mang về phòng thí nghiệm nuôi cấy phân lập.
Mẫu đất: Mỗi tỉnh tiến hành thu 15 mẫu. Tại mỗi trại thuộc một tỉnh, thu mẫu ở 5 vị trí khác nhau theo kiểu đường chéo, 10 g/mẫu, cách mặt đất 10cm rồi cho vào túi nhựa vô trùng, ghi nhãn địa điểm và thời gian lấy. Mẫu đất thu được tại 5 vị trí khác nhau mang về phòng thí nghiệm và gộp thành 1 mẫu.
2.3.2. Phân lập và tách thuần một số chủng vi khuẩn được thu từ mẫu ruột và đất
Mẫu ruột: Từ 1 ml dịch ruột cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước muối sinh lý để có độ pha loãng 10-1, lắc đều và dùng pipet hút 1 ml dung dịch cho vào ống nghiệm mới có chứa 9 ml nước muối sinh lý để có độ pha loãng tiếp theo (Belma và ctv, 2002).
Mẫu đất: Nghiền mịn 10 gram mẫu đất rồi cho vào cốc thủy tinh và thêm 10 ml nước muối sinh lý, lắc đều hỗn hợp, để yên 5 phút, sau đó dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù phía trên cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước muối sinh lý để có độ pha loãng 10-1 và tiếp tục pha loãng có nồng độ cần đạt (Nguyễn Tiến Dũng, 2009).
2.3.3. Khảo sát các đặc tính sinh hóa
Nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào: Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc về hình dạng, màu sắc, độ nổi. Và hình dạng tế bào sau 12-24 giờ ủ ở 37oC. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào của vi khuẩn được quan sát và ghi nhận dưới kính hiển vi quang học. Sau đó, tiến hành nhuộm Gram tế bào.
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa: Các thử nghiệm bao gồm khả năng sinh bào tử và khả năng di động. Từ kết quả khảo sát các đặc tính sinh hóa và kết quả nhuộm Gram, từ đó chọn ra các chủng vi khuẩn Bacillus để thực hiện các thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp, khả năng chịu muối mật, kháng kháng sinh và khả năng bám dính.
Đánh giá khả năng chịu pH thấp: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức ở mức pH khác nhau (2,5; 2,0 và 1,5) được thực hiện với 3 lần lặp lại. Nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự nhưng không chủng vi khuẩn vào (Erkkila và Petaja, 2000). Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường NB (ủ 37oC, 24 giờ, lắc 120 vòng/phút,), sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm để xác định và điều chỉnh mật độ vi khuẩn nằm trong khoảng 108 CFU/ml, OD=0,3-0,5 (Huff và ctv, 2002). Sau đó, thu lấy sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm (2.000 vòng/phút, 15 phút), thu cặn và ủ vào môi trường NB đã điều chỉnh pH (pH= 2,5; 2,0 và 1,5). Sau 3 giờ dịch nuôi ủ của vi khuẩn được xác định mật độ bằng phương pháp đếm sóng nhỏ giọt theo Hoben và Somasegaran (1982). Chọn các mức pha loãng có số lượng từ 30 đến 300 khuẩn lạc rời nhau rõ để đếm số khuẩn lạc (Koch, 1994), vì vậy từ đếm khuẩn lạc có thể xác định được mật độ vi khuẩn tại mức pha loãng tương ứng, từ đó xác định được mật độ vi khuẩn ban đầu với công thức tính mật độ vi khuẩn: Số tế bào/ml = A x 100 x B. Trong đó, A là số khuẩn lạc trung bình đếm được của 3 giọt (số khuẩn lạc/10µl), B là hệ số pha loãng (ví dụ 104; 105; 106;…) và 100 là hệ số chuyển đổi từ 10µl đến 1ml.
Đánh giá khả năng chịu muối mật: Các chủng vi khuẩn được ủ trong môi trường NB có bổ sung 0,3% muối mật (bile salt) và nghiệm thức đối chứng ủ trong môi trường NB có bổ sung 0,3% muối mật nhưng không có chủng vi khuẩn. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại. Sau 24 giờ tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường NB, sau đó đo OD để xác định và điều chỉnh mật độ vi khuẩn (Huff và ctv, 2002). Thu sinh khối tế bào sau khi tăng sinh được rửa với nước cất. Sau đó, từ 4 ống Eppendorf thu được vào 4 ống nghiệm NB có thể tích là 9 ml có bổ sung 0,3% muối mật đã được ký hiệu và lắc đều. Sau mỗi 0, 1, 2, 3 giờ, tiến hành pha loãng và đếm mật độ theo phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Gilliland và ctv,1984).
Đánh giá khả năng kháng các loại kháng sinh: Tiến hành khảo sát đối với 5 loại kháng sinh: kanamycin (30µg), streptomycin (10µg), gentamycin (10µg), tetracyclin (30µg) và ampicillin dựa trên phương pháp khuếch tán đĩa (disc diffusion) CLSI theo Cockerill (2011). Nhỏ 20µl dung dịch chứa vi khuẩn vào môi trường MHA với mật độ 106 cfu/ml và trải đều. Sau đó, đặt các đĩa kháng sinh lên (ủ 37oC trong 24-48 giờ). Sau thời gian ủ, đo đường kính vòng ức chế sinh trưởng và so sánh với các giá trị tiêu chuẩn về mức độ nhạy cảm với kháng sinh (Bauer và ctv, 1966).
Tiêu chuẩn để đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Bacillus dựa vào đường kính vòng ức chế sinh trưởng được thể hiện như sau: Kháng R≤6mm, nhạy cảm yếu 6<S+≤15mm, nhạy cảm vừa 15<S++≤26mm, nhạy cảm mạnh 26<S+++≤35mm (Nithya và Halami, 2012).
Đánh giá khả năng tự bám dính: Các chủng vi khuẩn được ủ trong dung dịch đệm phosphate PBS và nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn vào. Các chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic được tăng sinh trong môi trường NB và lắc trên máy lắc với tốc độ (120 vòng/phút, 37oC, 24 giờ), sau đó hút 1,5 ml dịch tăng sinh cho vào ống eppendorf, đem ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng/phút/20 phút, thu cặn và tái huyền phù trong đệm Phosphate buffered salin (PBS) sao cho nồng độ dung dịch tế bào vi khuẩn là 108 cfu/ml. Sau đó, dùng pipette hút 4 ml dung dịch vi khuẩn cho vào 4 ống nghiệm được ký hiệu lần lượt là T1, T2, T3 , T4. Đem ủ ở nhiệt độ 37oC và đo OD tương ứng của các ống nghiệm đã ký hiệu với các mốc thời gian là 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ. Khả năng tự bám dính được tính theo công thức: Khả năng tự bám dính (%)=(A0-At)/A0×100. Trong đó, A0: OD 600 của dung dịch tế bào ở thời điểm t=0 giờ và At: OD 600 dung dịch tế bào ở các thời điểm t=1, 2, 3, 4 giờ.
2.4. Xử lý số liệu
Số liệu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và Minitab 16.0.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhuộm Gram và khả năng bắt màu của những chủng vi khuẩn
Từ 60 mẫu dịch lỏng của ruột heo và 60 mẫu đất được thu tại 4 tỉnh phân lập được 68 chủng vi khuẩn, trong đó có 20 chủng vi khuẩn phân lập được tại tỉnh Bạc Liêu (chiếm 66,7%); chủng vi khuẩn phân lập được tại tỉnh Cà Mau gồm 19 chủng (chiếm 63,3%); đồng thời có 17 chủng vi khuẩn phân lập tại tỉnh Hậu Giang (chiếm 56,7%) và ở tỉnh Sóc trăng có 12 chủng vi khuẩn được phân lập chiếm (40,0%). Các chủng vi khuẩn phân lập được hầu hết đều phát triển nhanh, khuẩn lạc được quan sát rõ sau 12-24 giờ ủ ở nhiệt độ 37oC và có hình dạng tròn đều, màu trắng, bìa nguyên, mô. Sau đó, tiến hành quan sát hình thái tế bào với số tế bào vi khuẩn có dạng hình que chiếm tỷ lệ cao 72,1% gồm 49/68 chủng và số tế bào dạng hình cầu chiếm 27,9% gồm 19/68 chủng. Sau khi chọn được các chủng vi khuẩn hình que, tiến hành nhuộm Gram của 49 chủng vi khuẩn hình que, kết quả quan sát bắt màu cho thấy nhóm tế bào vi khuẩn Gram dương hình que chiếm tỷ lệ cao 83,7%, gồm 41/49 và chủng vi khuẩn Gram âm hình que chiếm 16,3%, gồm 8/49. Kết quả kiểm tra khả năng di động của 41 chủng vi khuẩn phân lập cho thấy khả năng di động chiếm tỷ lệ cao 78,1% (32/41 chủng). Tỷ lệ những chủng không có khả năng di động chiếm tỷ lệ thấp (21,9%) gồm 9/41. Các chủng vi khuẩn trên môi trường LB không có khả năng sinh bào tử, chiếm tỷ lệ cao 87,5% gồm 28/32 chủng và chỉ có 4/32 chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử chiếm 12,5%. Dựa vào kết quả hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, đặc điểm nhuộm Gram và các thử nghiệm sinh hóa, tuyển chọn được 4 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus.
3.2. Khả năng chịu pH thấp
Như vậy, dưới tác động của pH thấp, hầu hết các chủng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng sống sót với mật số vi khuẩn giảm dần từ pH=2,5 xuống pH=1,5 dao động trong khoảng 3,4-6,1 log CFU/ml . Trong một chủng vi khuẩn khi khảo sát khả năng chịu 3 mức nồng độ pH thấp (2,5; 2,0 và 1,5) thì khả năng sống sót của vi khuẩn ở mỗi nồng độ pH là khác nhau. Với 2 chủng ST.R.B9 và HG.R.B3 khi chịu tác động pH=2,5-2,0 thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê, nhưng có khác biệt ý nghĩa với pH=1,5. Đối với 2 chủng CM.Đ.B14 và CM.R.B12, chúng có khác biệt ý nghĩa thống kê (P<0,05) dưới sự tác động ở cả 3 nồng độ pH thấp.
Cả 4 chủng đều có khả năng sống trong điều kiện pH thấp đặc biệt là pH=1,5. Vì mức pH=1,5 đây là điều kiện pH rất thấp đối với sự tồn tại của nhiều nhóm vi sinh vật và có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sinh enzyme và sự trao đổi chất của vi sinh vật. Do đó, phần lớn các vi sinh vật bị ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển khi điều kiện pH 2 hoặc thấp hơn (Cakir, 2003). Kết quả khảo sát cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đều có khả năng chịu đựng được pH thấp, có khả năng chống chịu với điều kiện axít của dạ dày để đi đến ruột non. Theo Trần Thị Bích Quyên (2012) khi khảo sát khả năng chịu pH thấp (1,5-2,5) của các chủng Bacillus được ký hiệu Q1, Q16, Q22 và Q29 tại các thời điểm 0, 1, 60, 90, 180 phút, kết quả cho thấy dưới tác động của pH thấp, hầu hết các chủng khảo sát đều có khả năng tồn tại với tỷ lệ sống sót đạt 39,94-76,23%. Nghiên cứu của Wang và Gu (2010), cho thấy Bacillus pumilus có khả năng sống sót trong điều kiện pH=2,5 và 2,0 với tỷ lệ tế bào sống sót hơn 80% sau 90 phút khảo sát.
3.3. Khả năng chịu muối mật
Khả năng chịu muối mật được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri sau khi ủ ở 37oC trong khoảng thời gian 0, 1, 2 và 3 giờ tương ứng với thời gian lưu thức ăn trong ruột non (Kumura và ctv, 2004). Theo Gilliland và ctv (1984), 0,3% được xem là nồng độ quyết định để sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng chống chịu muối mật.
Tỷ lệ mật độ của 4 chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ với muối mật đều tăng so với ban đầu. Nhìn chung, ở mỗi chủng vi khuẩn Bacillus có mật độ khả năng chịu muối mật 0,3% đều tăng dần và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) ở mỗi thời gian khảo sát. Tuy nhiên, chủng CM.Đ.B14 ở thời điểm khảo sát 1 giờ và 2 giờ không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. So với nghiên cứu của Lee và ctv (2017) chủng MKSK-M1 phân lập từ sản phẩm đậu tương lên men truyền thống của Hàn Quốc có khả năng sinh trưởng 99,3% khi ủ với muối mật 0,3% thì kết quả nghiên cứu hiện tại cũng tương đồng. Theo nghiên cứu của Trần Quốc Việt và ctv (2009), các chủng vi sinh vật thử nghiệm đều có khả năng tồn tại trong môi trường chứa muối mật với nồng độ 0,3%. Kết quả nghiên cứu của Dương Nhật Linh và ctv (2011) ở nồng độ muối mật 0,3% sau 3 giờ hầu hết các chủng có tỷ lệ sống cao trên 90% là K5, R4, S1, S2, S6, K6, S7, R6, Y1, R9, K9, R14, K15 S8, Y7, K13 trong đó chủng R4 cao nhất là 116%.
3.4. Khả năng kháng kháng sinh
Bốn chủng Bacillus đều không có khả năng kháng lại với Kanamycin, Streptomycin, Gentamycin và Tetracyclin. Tuy nhiên, chủng Bacillus có khả năng kháng lại với Tetracyclin là ST.R.B9 chiếm 25%, có 2 chủng ST.R.B9 và CM.Đ.B14 có khả năng kháng lại với Ampicillin và Tetracyclin chiếm 50%. Do đó có thể sử dụng kết hợp 2 chủng Bacillus trong quá trình sử dụng kháng sinh (Tetracyclin và Ampicillin) để bổ sung vào khẩu phần ăn cho heo mà không làm mất đi hoạt tính cũng như sự tồn tại của các chủng Bacillus trong đường ruột. Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Đức (2014) thì cho thấy kết quả tương tự, 2 chủng Bacillus được ký hiệu CH16 và CH24, trong đó CH16 có khả năng kháng lại với Ampicillin và Clindamycin, còn CH24 có khả năng kháng lại với Tetracyclin và kết quả nguyên cứu của Adzitey và ctv (2013) cho thấy vi khuẩn đã kháng với nhiều loại kháng sinh, trong đó 60% kháng với Vancomycin, 92,7% kháng với Tetracylin, tỷ lệ kháng với Ampicillin là 72,7%, Streptomycin và Sulfamethoxazole-trimethoprim là 67,3%.
3.5. KHả năng tự bám dính
Tỷ lệ tự bám dính của các chủng Bacillus có xu hướng tăng dần theo thời gian (từ 1 giờ đến 4 giờ). Ở mỗi giờ ủ, mức độ bám dính của các chủng gần như tăng gấp đôi so với thời điểm ban đầu. Sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ 37oC, các chủng có tỷ lệ tự bám dính dao động 18,0-37,1%. Tại thời điểm 1 giờ, 2 chủng ST.R.B9 (8,3%) và CM.Đ.B14 (8,2%) đạt tỷ lệ tự bám dính cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) với các 2 chủng còn lại. Ở Bảng 5 cũng cho thấy, ở mỗi chủng với mỗi giờ khảo sát có tỷ lệ bám dính tăng dần và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Tuy nhiên, ở chủng HG.R.B3 ở thời điểm 1 giờ và 2 giờ không có khác biệt ý nghĩa thống kê (P>0,05) nhưng có khác biệt ý nghĩa thống kê (P<0,05) với thời điểm 3 giờ, 4 giờ.
Kết quả nghiên cứu này tương tự với của Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv (2010) tỷ lệ tự bám dính các chủng Bacillus cũng được thể hiện tỷ lệ với giá trị cao nhất ở chủng B. pumilus (37,2%) và thấp nhất ở chủng B. clausi (15,5%). Kết quả nghiên cứu của Sansawat và Thirabunyanon (2009) đã ghi nhận được tỷ lệ tự bám dính của B. subtilis P33 và B. subtilis P72 là khá cao với tỷ lệ lần lượt là 35,7% và 42,2%. Bên cạnh đó nghiên cứu của David và ctv (2016) đã báo cáo khả năng tự bám dính của chủng B. subtilis P11 là 27%, và B. subtilis W4 là 37%, đây là 2 chủng có tỷ lệ bám dính cao nhất trong tổng số 11 chủng B. subtilis khảo sát.
4. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn ST.R.B9 và CM.Đ.B14 có đặc tính probiotic, có thể sử dụng làm chế phẩm sinh học phục vụ trong chăn nuôi heo
Trịnh Thị Hồng Mơ và CS
Trường Đại học Cần Thơ
