Hoạt tính in vitro của 4 loại kháng sinh (Danofloxacin, Doxycycline, Ceftiofur, Cefquinome) được xác định bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với một số chủng vi khuẩn phân lập từ gia súc và gia cầm mắc bệnh ở thành phố Cần Thơ. Kết quả cho thấy E.coli, Salmonella, Klebsiella và Staphylococcus có tỷ lệ đề kháng với Danofloxacin tương ứng là 100%, 80%, 55% và 90%, với Doxycycline tương ứng là 95%, 60%, 75% và 55% và với Ceftiofur tương ứng là 50%, 50%, 60% và 90% với từng loại vi khuẩn. Hiện tại các loại vi khuẩn này còn nhạy cảm cao với Cefquinome theo tỷ lệ tương ứng là 85%, 80%, 75% và 75%. Hầu hết các loại vi khuẩn trên đều có tính đa kháng và phổ biến nhất là đề kháng với 2-3 loại kháng sinh.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đề kháng kháng sinh hay còn gọi là kháng thuốc, không là vấn đề mới, nhưng trước tình hình phát triển của dịch bệnh như hiện nay thì việc ngăn chặn, khắc phục tình trạng đề kháng kháng sinh là vô cùng quan trọng và cấp bách, mang tính toàn cầu. Tình trạng các vi khuẩn, virus, nấm, kí sinh trùng không còn mẫn cảm với các thuốc kháng sinh đã mẫn cảm trước đó, thông thường chính là hệ quả của quá trình sử dụng, sự gia tăng sử dụng và lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị. Sự đề kháng với kháng sinh làm cho các loại thuốc đặc hiệu mất dần tác dụng điều trị, hiệu quả điều trị kém, kéo dài (thậm chí có thể tử vong) gây tốn kém tiền của, thời gian, công sức của bệnh nhân, gây hao hụt ngân sách quốc gia. Đề kháng với kháng sinh còn xuất hiện trong lĩnh vực chăn nuôi, nhất là chăn nuôi gia súc gia cầm. Trong khi nước ta là một nước nông nghiệp và chăn nuôi là một thế mạnh thì thiệt hại đối với ngành này là không phải nhỏ. Bên cạnh đó, đề kháng kháng sinh trong chăn nuôi có khả năng truyền các gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh trên người hoặc gây bệnh trực tiếp cho người. Hiện nay một số kháng sinh thường được dùng trong phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm như doxycycline, danofloxacin, ceftiofur. Một loại kháng sinh mới khác cũng bắt đầu sử dụng trong chăn nuôi đó là cefquinome, nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về loại kháng sinh mới này ở Việt Nam.
Nhằm góp phần nghiên cứu về tình trạng đề kháng kháng sinh đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi, ngành kinh tế trọng điểm có mối quan hệ trực tiếp tới đời sống và sức khỏe của cộng đồng, chúng tôi thực đề tài này với mục đích tìm ra loại kháng sinh còn mẫn cảm cao với các chủng vi khuẩn để ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm.
NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung
Khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn in vitro của 4 loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome trên 4 loại vi khuẩn thường được phân lập từ gia súc, gia cầm mắc bệnh ở Cần Thơ: E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp.,Staphylococcus spp.
Đối tượng và thời gian
Các chủng vi khuẩn: E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp. Các loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome. Thời gian: từ 08-11/2013.
Phương pháp
Qui trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sử dụng phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng được tuân thủ theo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012).
Xử lý số liệu
Số liệu được nhập, xử lý sơ bộ trên Excel và xác định sai khác ý nghĩa thống kê bằng Chi-Square Test của phần mềm Minitab 13.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn E. coli
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome trên 20 chủng vi khuẩn E. coli được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn E. coli.
Cefq (cefquinome). nồng độ kháng ≥8μg/ml, Ceft (ceftiofur),nồng độ kháng ≥4μg/ml.
Bảng 1 cho thấy tại mật độ 106 CFU/ml vi khuẩn E. coli đề kháng cao với danofloxacin, doxycycline với tỉ lệ là 100% và 95% và kháng với ceftiofur là 50%. Vi khuẩn E. coli có tỷ lệ nhạy cảm cao đối với cefquinome (85%) và nhạy với ceftiofur (50%).
Trong số 20 chủng thử nghiệm thì 100% số chủng cho MIC >50 µg/ml đối với danofloxacin và 19/20 chủng cho MIC ≥25 µg/ml đối với doxycycline. Thực trạng này có thể là kết quả của việc sử dụng thường xuyên 2 nhóm kháng sinh này trong điều trị. Kết quả này có phần cao hơn các nghiên cứu trước đây trên các kháng sinh cùng nhóm. Theo báo cáo của Hồ Xuân Ngân (2007), tỉ lệ E. coli đề kháng đối với ciprofloxacin, norfloxacin, tetracycline lần lược là 14,29%, 3,60% và 53,51%, còn trong nghiên cứu của Thảo (2008) thì tỉ lệ E. coli đề kháng với doxycycline là 56,00%. Một nghiên cứu khác của Huỳnh Thị Mỹ Hạnh (2010), cho thấy E. coli có tỉ lệ đề kháng đối với ciprofloxacin, norfloxacin, tetracycline là 22,22%, 11,11%, 55,56%. Nguyên nhân sự khác biệt của các kết quả nghiên cứu là do thời điểm nghiên cứu khác nhau, vị trí địa lý, đối tượng lấy mẫu, phương pháp lấy mẫu khác nhau và tình hình diễn biến dịch bệnh. Tuy nhiên E. coli còn nhạy cảm cao đối với cefquinome (85,%) và ceftiofur (50%).
Khảo sát MIC cho thấy trong số 20 chủng thử nghiệm thì có đến 13 chủng cho kết quả nhạy cảm với cefquinome ở mức MIC ≤0,78 µg/ml chiếm tỉ lệ 65%, trong đó gồm có 6 chủng nhạy ở mức 0,10 µg/ml, 2 chủng nhạy ở mức 0,20 µg/ml, 3 chủng nhạy ở mức 0,39 µg/ml và 1 chủng nhạy ở mức 0,78 µg/ml. Kết quả này cho thấy tính kháng của E. coli chưa phát triển mạnh đối với cefquinome. Vì cefquinome là kháng sinh mới được sử dụng trong thời gian gần đây và giá thành cao do đó người nuôi chưa sử dụng nhiều nên các chủng kháng thuốc chưa phát triển mạnh đối với kháng sinh này. Qua khảo sát MIC tại mật độ 105 CFU/ml cho thấy có sự thay đổi nhỏ tỉ lệ đề kháng đối với doxycycline (từ 95% xuống còn 80%) và đối với cefquinome là (10% xuống còn 5%). Bằng phương pháp so sánh Chi quare test tỉ lệ kháng tại mật độ 106CFU/ml và mật độ 105 CFU/ml cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P = 0,934). Kết quả này nói lên rằng không có sự phụ thuộc giữa mật độ vi khuẩn và tỉ lệ kháng, vì một khi vi khuẩn đã mang gene kháng một thuốc bất kì thì ở mật độ nào vi khuẩn cũng có khả năng đề kháng với thuốc đó.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Staphylococcus spp.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome đối với 20 chủng vi khuẩn Staphylococcus spp được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn Staphylococcus spp.
Từ Bảng 2 cho thấy tỉ lệ vi khuẩn Staphylococcus spp. đề kháng với 3 loại kháng sinh luôn ở mức cao (≥55%). Kết quả khảo sát MIC tại mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml cho thấy Staphylococcus spp có tỉ lệ đề kháng cao đối với danofloxacin, ceftiofur, doxycyline, tỉ lệ đề kháng lần lượt là 90%, 90%, và 55% và Staphylococcus spp có tỷ lệ nhạy cao với cefquinome (75%). Một số nghiên cứu cho thấy Staphylococcus aureus gây bệnh viêm vú trên bò sữa có tỉ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, tetracycline ở mức 4,88%, 7,32%, và 36,59% (Võ Thị Huyền Trâm, 2007) và kháng với enrofloxacin, doxycycline, ceftiofur lần lược là 33,33%, 41,87%, 8,38% (Huỳnh Thị Mỹ Hạnh, 2010). Sự khác biệt này có thể do thời điểm nghiên cứu, cũng như các chủng vi khuẩn được phân lập từ các đối tượng khác nhau.Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy khi giảm mật độ vi khuẩn thì tỉ lệ đề kháng có biểu hiện giảm theo nhưng không đồng loạt ở mọi kháng sinh. Tỉ lệ kháng giảm nhiều nhất đối với danofloxacin và ceftiofur từ 90% xuống còn 65%, và 70% (tại 105CFU/ml) và không đổi đối với doxycycline.Tỉ lệ kháng của vi khuẩn Staphylococcus spp tại mật độ 106 CFU/ml và 105CFU/ml cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Điều này cho thấy tính kháng thuốc không phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn. Bởi một khi vi khuẩn đã mang gene đề kháng với kháng sinh thì tại bất cứ mật độ nào gene đó cũng tồn tại và tính kháng thuốc vẫn được bảo toàn.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Salmonella spp.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh: danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome trên 20 chủng vi khuẩn Salmonella spp. được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn Salmonella spp.
Qua khảo sát MIC tại mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml cho thấy giá trị MIC của 4 loại kháng sinh đối với Salmonella spp. phân bố trong khoảng 0,78 µg/ml đến > 50 µg/ml. Theo kết quả phân loại thu được tỉ lệ số chủng Salmonella spp. đề kháng với danofloxacin, doxycycline, ceftiofur lần lược là 80%, 60%, và 50%. Tỉ lệ kháng tại mật độ 105 CFU/ml có biểu hiện giảm đối với danofloxacin (từ 80% xuống còn 70%), ceftiofur (từ 50% xuống còn 40%) và doxycycline (từ 60% xuống còn 50%). Kết quả này cho thấy tính kháng thuốc của Salmonella spp có giảm khi giảm nồng độ vi khuẩn.Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tỉ lệ đề kháng của Salmonella spp với kháng sinh tại hai mật độ cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa trong thống kê (P = 0,808), không phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn. Ngoài ra tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella tại mật độ 106 CFU/ml cao nhất đối với danofloxacin (80%), kế đến là doxycycline (60%) và ceftiofur (50%). Mức đề kháng cao đối với danofloxacin có thể là do Salmonella đã hình thành cơ chế kháng nhóm flouroquinolone thông qua việc sử dụng phổ biến các kháng sinh trong nhóm flouroquinolone trong phòng ngừa và điều trị bệnh cho vật nuôi. Theo một số báo cáo gần đây cho thấy các kháng sinh cùng nhóm flouroquinolone và tetracycline đang bị đề kháng mạnh. Cụ thể là tỉ lệ Salmonella spp. đề kháng với oxytetracycline là 45%, kháng ofloxacin là 83,3% (Trần Đỗ Hùng & cs 2011), kháng tetracycline là 75%, kháng norfloxacin là 50% (Nguyễn Bữu Châu, 2007). Tuy chưa có các báo cáo tiến hành trong nước về tình hình đề kháng với các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, 4 nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện phổ biến các gene sinh men beta-lactamase trong đó có cephalosporinase là nguyên nhân chính khiến các kháng sinh cephalosporin mất tác dụng.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩncủa 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Klebsiella spp.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại kháng sinh Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome đối với 20 chủng vi khuẩn Klebsiella spp được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn Klebsiella spp.
Tại mật độ 106 CFU/ml vi khuẩn Klebsiella spp đề kháng đề kháng cao với doxycycline, ceftiofur, danofloxacin tương ứng với tỉ lệ 75%, 60%, 55%. Tỉ lệ nhạy với cefquinome là cao nhất với 75%. Tại mật độ 105 CFU/ml tỉ lệ đề kháng của Klebsiella spp đối với danofloxacin, doxycycline, ceftiofur cũng giảm nhẹ so với kết quả tại mật độ 106 CFU/ml tương ứng là 50%, 70% và 55%.
So sánh tỉ lệ số chủng Klebsiella spp đề kháng tại mật độ 106 CFU/ml và mật độ 105 CFU/ml cho thấy sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Điều này cho phép kết luận tính kháng thuốc của vi khuẩn không phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn. Qua bảng 4, nhận thấy cefquinome ít bị Klebsiella spp đề kháng hơn so với 3 kháng sinh còn lại. Có 2 lý do sau giải thích điều này như sau: (i) do kháng sinh này mới được lưu hành, chưa được sử dụng phổ biến cho nên tỉ lệ kháng kháng sinh do việc sử dụng kháng sinh còn ở mức thấp va (ii) do cefquinome có hoạt lực mạnh trên vi khuẩn Gram âm, tương đối bền dưới sự tác động của men beta-lactamase. Điều này thấy rõ ở một số chủng cho kết quả đề kháng đối với danofloxacin và ceftiofur (>50 µg/ml) nhưng vẫn cho giá trị MIC đối với cefquinome từ 1,56 đến 0,2 µg/ml.
Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn E.coli, Salmonella spp, Klebsiella spp và Staphylococcus với các loại kháng sinh
Bảng 5 Kết quả khảo sát tính đa kháng của các chủng vi khuẩn
E. coli có khả năng đề kháng cùng lúc với nhiều kháng sinh. Có 95% số chủng đề kháng từ 2 đến 4 loại kháng sinh (19/20). Trong đó có 45% đề kháng với 2 loại kháng sinh (9/20), 40% đề kháng với 3 loại kháng sinh (8/20) và 10% đề kháng với 4 loại kháng sinh (2/20). Kết quả này phù hợp với nhận định của Bùi Thị Tho (2003) cho rằng vi khuẩn E.coli có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Và cũng phù hợp với kết quả của Nguyễn Minh Lực (2007) khi có trên 40% số chủng kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Trát Minh Thụy (2011) là có 93,75 số chủng vi khuẩn E.coli kháng từ 2 loại kháng sinh trở lên, trong đó có 21,29% số chủng kháng với 4 loại kháng sinh.
Qua bảng 5 cho thấy có 45% số chủng Salmonella đề kháng cùng lúc với 2 loại kháng sinh, trong đó kháng cùng lúc với danofloxacin và doxycycline là 30% (6/20), Danofloxacin với ceftiofur là 15% và 30% số chủng Salmonella đề kháng cùng lúc với 3 loại kháng sinh (danofloxacin, doxycycline và ceftiofur), không có chủng nào đề kháng với cefquinome. Kết quả này cũng tương tự với Phạm Thị Như Thảo (2011), có 63,3% số chủng Salmonella kháng với 2 loại kháng sinh và 20% số chủng kháng với 3 loại kháng sinh. Từ đó cho thấy tình trạng đề kháng hay đa đề kháng với kháng sinh cũng khá phổ biến.Vì vậy sự đề kháng với kháng sinh của Salmonella là rất đáng quan tâm. Đặc biệt là đối với các chủng Salmonella gây bệnh cho người. Tính đa kháng phổ biến trên họ trực khuẩn Gram âm trong đó có vi khuẩn Salmonella spp. Nguyên nhân chính là do chúng dễ dàng thu nhận các R-plasmid từ các cá thể cùng loài hoặc khác loài, sự thu nhận các R-plasmid được tích lũy theo thời gian và hình thành nên tính đa kháng.
Từ bảng 5 cũng cho thấy có 70% số chủng Klebsiella đề kháng từ 2 – 4 loại kháng sinh, trong đó cao nhất là đề kháng với 3 loại kháng sinh chiếm 40%, 25% đề kháng với 2 loại kháng sinh và bắt đầu có sự xuất hiện chủng Klebsiellakháng với 4 loại kháng sinh chiếm 5%. Nhiều nghiên cứu cho thấy cơ chế ESBL kháng phổ rộng xuất hiện chủ yếu trên vi khuẩn E. coli và Klebsiella spp. Cơ chế này giúp vi khuẩn có thể đề kháng với nhiều kháng sinh có cấu trúc beta-lactam. Ngoài ra việc đề kháng chéo đối với flouroquinolone có thể xảy ra khi vi khuẩn sinh ESBL (Đoàn Mai Phương,2008).
Đối với vi khuẩn Staphylococcus có đến 85% số chủng đề kháng từ 2-3 loại kháng sinh. Trong đó có 55% số chủng đề kháng với 2 loại kháng sinh và 30% số chủng đề kháng với 3 loại kháng sinh. Theo các nhà khoa học, tụ cầu khuẩn có khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh cùng lúc là do cơ chế sinh men beta-lactamase trong đó men beta-lactamase phổ rộng có hoạt lực cao và chiếm tỉ lệ lớn (Trần Đỗ Hùng và Trần Thái Ngọc, 2013). Các enzym này có tác dụng phá hủy cấu trúc vòng beta-lactam làm cho các kháng sinh có cấu trúc beta-lactam mất tác dụng (điển hình là MRSA). Ngoài ra các gene đề kháng khác có thể du nhập dễ dàng qua thể truyền plasmid theo phương thức tiếp hợp.Theo một số nghiên cứu trước đây, sự đề kháng các thuốc thuộc nhóm tetracycline là do việc sử dụng các thuốc này trong thời gian dài với liều thấp nhằm phòng bệnh đã tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát triển. Nhóm thuốc này tạo ra chủng kháng thuốc chậm và biến động theo thời gian. Nếu sử dụng với nồng độ thấp và trong thời gian dài dễ tạo nên chủng kháng thuốc thông qua thể truyền plasmid (Akinbowale & cs, 2005). Nhiều nghiên cứu cho thấy các R-plasmid kháng tetracycline đã xuất hiện trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật (Schmidt & cs, 2001).
KẾT LUẬN
Qua việc khảo sát MIC của 4 loại kháng sinh trên 80 chủng thuộc 4 nhóm vi khuẩn khác nhau, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Các loại vi khuẩn E. coli, Salmonella, Klebsiella và Staphylococcus đề kháng cao với danofloxacin, doxycycline và ceftiofur.
Các loại vi khuẩn E. coli, Salmonella, Klebsiella và Staphylococcus còn nhạy cảm cao với cefquinome tương ứng 85%, 80%, 75% và 75%.
Tính đa kháng mạnh trên vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương (> 80%), trong đó các loại vi khuẩn kháng chủ yếu từ 2-3 loại kháng sinh.
Nguyễn Đức Hiền1, Huỳnh Minh Trí*2
1 Bộ môn Thú Y, Khoa NN và SHƯD, Đại học Cần Thơ
2 Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim
