Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn Lactic dùng trong chế biến thức ăn thô xanh và phụ phẩm cho gia súc nhai lại

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi quan tâm. Nó giúp thức ăn cho động vật không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng trong thời gian dài. Bảo quản thức ăn cho gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra là một phương pháp bảo quản được nhiều quốc gia trên thế giới ứng dụng.

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình lên men hiệu quả hơn. Phân loại bằng sinh học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit lactic góp phần quan trọng trong việc lựa chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an toàn về mặt sinh học.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước bún. – Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi, Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) – Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2. Môi trường nghiên cứu

– Môi trường MRS thạch (g/l): Glucoza20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0; CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121oC/15 phút. – Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO3.

– Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật kiểm định(g/l): Cao thịt – 3,0; Pepton- 5,0; NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1 lít; pH 7,0; khử trùng 121oC/15 phút.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng

– Định lượng axit theo Therner (Emanuel và cộng sự, 2005)

– Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989)

2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic

– Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972)

– Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men đồng hình; chịu nhiệt; kháng khuẩn; sinh bacterioxin; sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất (tinh bột, casein, pectin, xylan, CMC) và khả năng đối kháng theo các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1972).

2.2.3. Phương pháp phân loại

– Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992)

– Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S

Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009). Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Genetic AnalyzerMỹ). Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal X của Thompson và cộng sự, 1997. Các trình tự được so sánh với trình tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein, 1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình

3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit

Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà, nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2 ngày ở nhiệt độ 30oC.

3.1.2. Tuyển chọn các vi khuẩn lactic

– Xác định khả năng sinh axit lên men đồng hình của các vi khuẩn phân lập

Các chủng phân lập được nuôi trên môi trường MRS dịch thể có đặt ống Durham. Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng phân lập có 131 chủng không sinh khí trong ống Durham là lên men đồng hình.

– Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi khuẩn sinh axit

Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động phải có khả năng sinh trưởng được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động vật. Dựa vào tiêu chí này, 131 chủng lên men đồng hình được nuôi trên môi trường MRS ở 37oC và đã lựa chọn được 70 chủng có khả năng phát triển tốt tại nhiệt độ này dùng cho nghiên cứu tiếp theo.

– Xác định khả năng sản sinh axit của các vi khuẩn sinh axit

Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của dịch nuôi cấy được xác định. Kết quả cho thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ 20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19 mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit từ 8-14 mg/ml.

– Xác định khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn

Để xác định khả năng sinh axit lactic của 18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi cấy của các chủng này được định lượng axit lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng thời cũng xác định khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh. Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M. luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20- 34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm.

Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi các chủng nghiên cứu cũng được xác định. Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm định. Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn kiểm định. Kích thước vòng kháng (D-d) đối với E. coli từ 8-12 mm, M. luteus từ 2-6 mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella flexneri 10-12 mm.

Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm tra một số đặc tính sinh học và tiến hành phân loại.

– Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng lựa chọn

Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS trong 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có chứa các cơ chất. Khả năng sinh enzyme được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất.

Kết quả bảng trên cho thấy 7 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym ngoại bào phân giải các cơ chất (trừ chủng L01). Như vậy, ngoài khả năng sinh axit cao, các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi.

– Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn

Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên môi trường MRS bằng phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau. Sau 3 ngày, ở nhiệt độ 37oC, ở tất cả các mẫu đều sinh trưởng tốt. Kết quả này cho thấy 8 chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc.

3.2. Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn

3.2.1. Xác định trình tự 16S ADNr và xây dựng cây phân loại ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu được tách chiết.

Đoạn gen mã cho ARNr 16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và mồi ngược. Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài.

Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên cứu được xác định. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus và Lactobacillus. Pediococcus acidilactici được sử dụng làm nhóm ngoài.

Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus lactis (hình 1). So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17 có mức tương đồng 99,7-100 % với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 có mức tương đồng 99,9 % với Enterococcus lactis.

3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính, không có khả năng di động, lên men đồng hình, có khả năng đông tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5; nhiệt độ 20- 40oC và nồng độ muối 0-8%. Hình thái tế bào có 2 dạng: hình que (chủng 2-9, 2-10, 3- 5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17) và hình cầu (chủng L01). Các chủng có khả năng lên men và tạo axit từ các nguồn cacbon: glucose, L-arabinose, D-fructose, galactose (trừ chủng 4-14), D-lactose (trừ chủng 8- 10), maltose, D-mannitol, D-raffinose (trừ chủng 4-14), D-ribose, sucrose, D-sorbitol, và trehalose (trừ chủng 4-14 và 8-10). Sáu trong số các chủng nghiên cứu không lên men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ chủng 2-9 và L01).

Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100% so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus plantarum. Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu trước đây, L. pentosus thường lên men glycerol và xylose trong khi L. plantarum và L. paraplantarum không lên men các nguồn này (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni và cộng sự, 1987; Swezey và cộng sự, 2000; Bringel và cộng sự, 1996; Curk và cộng sự, 1996). Khác với L. plantarum, L. paraplantarum thường không đồng hóa arabinose và sorbitol (Curk và cộng sự, 1996). Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm sinh lý, sinh hoá có thể xếp chủng 2-9 thuộc loài Lactobacillus pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17 thuộc loài Lactobacillus plantarum. Chủng L01 có tế bào hình cầu, có các đặc điểm thuộc loài Enterococcus lactis.

Các chủng được lựa chọn đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh vật được AAFCO (American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế biến thức ăn.

Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp. Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội

Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền. Viện Chăn nuôi

Channuoivietnam.com © 2013 được phát triển bởi Viện Công Nghệ Sáng Tạo - Email: dohuuphuong2010@gmail.com - ĐT: 0908.255.265 Trang chủ